去年備受關(guān)注的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，讓“免疫負(fù)調(diào)控”的發(fā)現(xiàn)者詹姆斯·艾利森和本庶佑聲名顯赫?！懊庖哓?fù)調(diào)控”發(fā)生在抗原呈遞期間，即初始T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞之間傳遞抗原信號，以及細(xì)胞識別期間，即效應(yīng)T細(xì)胞遷移進(jìn)入腫瘤組織，與腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞之間傳遞識別信號期間。

      大部分腫瘤細(xì)胞就是充分利用“免疫負(fù)調(diào)控”，來抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫活性，從而逃避免疫系統(tǒng)的追殺。具體地說，在正常狀態(tài)下，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時，NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及表皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面會被誘導(dǎo)表達(dá)PD-L1蛋白。當(dāng)這些細(xì)胞和被激活的T細(xì)胞接觸時，PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的免疫活性，避免過激的炎癥反應(yīng)對自身的傷害。因為這些細(xì)胞表面表達(dá)的PD-L1程度比較低，所以可以避免對T細(xì)胞活性的消耗。然而腫瘤細(xì)胞大不一樣，它們在細(xì)胞表面大量表達(dá)PD-L1，能夠幾乎完全抑制與它們接觸的所有T細(xì)胞的免疫活性，造成T細(xì)胞活性耗竭，并逃避免疫系統(tǒng)的追殺，最終惡性繁殖擴(kuò)增，危及生命。（圖1）

圖1 ：免疫負(fù)調(diào)控示意圖

（a）當(dāng)T細(xì)胞對抗原產(chǎn)生初次響應(yīng)時，CTLA-4介導(dǎo)的免疫檢查點(diǎn)被誘導(dǎo)激活。這種由CTLA-4介導(dǎo)的誘導(dǎo)激活程度，依賴于起始T細(xì)胞受體調(diào)整的信號強(qiáng)度。高親和配體能夠誘導(dǎo)表達(dá)更多的CTLA-4，從而減弱了起始響應(yīng)的強(qiáng)度。當(dāng)T細(xì)胞受體遭遇抗原后，誘導(dǎo)下游通路，CTLA-4被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，此時CTLA-4起到信號減弱的功能，以維持一個恒定的T細(xì)胞激活水平。（b）與CTLA-4不同，PD-1信號通路并不在起始T細(xì)胞激活階段起作用，而是在外周組織中，效應(yīng)T細(xì)胞識別組織中的抗原，以調(diào)節(jié)炎癥響應(yīng)的過程中。這些組織中的炎癥信號（IFN-γ，主要由I型輔助T細(xì)胞表達(dá)）能夠誘導(dǎo)組織細(xì)胞中的PD-L1的表達(dá)，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞對其免疫響應(yīng)。在慢性抗原暴露的情況下，T細(xì)胞表面過量誘導(dǎo)的PD-1，可以引發(fā)T細(xì)胞的活性耗竭。（c）在腫瘤細(xì)胞中，PD-L1的表達(dá)或不依賴于腫瘤微環(huán)境中的炎癥信號，AKT、STAT3信號通路的激活可誘導(dǎo)表達(dá)PD-L1，或依賴于炎癥信號，表達(dá)下游的免疫檢查點(diǎn)抑制蛋白。

        目前，腫瘤的聯(lián)合免疫療法越來越體現(xiàn)出它的優(yōu)越性。一方面，要減少腫瘤靶向結(jié)合的非特異性，減少治療過程對正常細(xì)胞的殺傷，我們需要盡可能地將免疫系統(tǒng)引起的細(xì)胞毒性局限在腫瘤組織中（靶向藥物）。另一方面我們需要解除腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的免疫負(fù)調(diào)控，提高免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性（免疫負(fù)調(diào)控抑制），使腫瘤殺傷單抗藥物的腫瘤殺傷作用更能發(fā)揮威力。

        在這些治療方案中，都以T細(xì)胞免疫為核心。雖然細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用具有一定的特異性，然而極優(yōu)而劣。因為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性，來源于被殺傷細(xì)胞的MHC-I型抗原遞呈。只有識別了目標(biāo)細(xì)胞通過MHC-I遞呈的抗原，細(xì)胞毒性T細(xì)胞才能特異性的殺傷靶細(xì)胞。然而，狡猾的腫瘤細(xì)胞，有相當(dāng)一部分關(guān)閉了其細(xì)胞表面MHC-I類分子的表達(dá)，比如，92%的宮頸癌細(xì)胞，71%的乳腺癌細(xì)胞，64%的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。這樣我們英勇無比的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對它們就無能為力了。

“如之奈何？”

        幸運(yùn)的是，對付這類狡猾的腫瘤細(xì)胞，我們有免疫系統(tǒng)的另一殺手，自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer Cell， NK細(xì)胞）。

        NK細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞，是一種具有細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞，屬于天然免疫系統(tǒng)。NK細(xì)胞與獲得性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，扮演著相近的角色。NK細(xì)胞對病毒感染的細(xì)胞，或者腫瘤形成，有著極快的響應(yīng)速率。通常情況下，免疫細(xì)胞檢測到感染細(xì)胞表面的MHC，引起細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解或凋亡。但NK細(xì)胞有所不同，它們可以在沒有抗體或MHC的情況下，識別這些細(xì)胞并進(jìn)行快速的免疫響應(yīng)。對于那些失去自身標(biāo)記的MHC-I型的細(xì)胞，NK細(xì)胞不經(jīng)過激活就可以進(jìn)行殺傷。而這些細(xì)胞通常是有害的，不能被其他免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并消滅，比如細(xì)胞毒性T細(xì)胞。（圖2）

圖2 NK細(xì)胞的“丟失自我”的殺傷機(jī)制

        NK細(xì)胞通過自身表面的激活型和抑制型受體，調(diào)節(jié)自身的細(xì)胞毒性，比如殺傷細(xì)胞類免疫球蛋白受體。大部分受體不僅表達(dá)在NK細(xì)胞上，也表達(dá)在T細(xì)胞上。抑制型受體識別并結(jié)合MHC-I，這樣也可以解釋NK細(xì)胞殺傷那些沒有表達(dá)MHC-I的細(xì)胞。而MHC-I在抗原呈遞過程中，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞。但是，當(dāng)被感染或變異的細(xì)胞，逐漸降低表達(dá)MHC-I，使它們自身免于被T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，規(guī)避T細(xì)胞免疫。而NK細(xì)胞正好彌補(bǔ)了這一點(diǎn)。

        盡管NK細(xì)胞并不需要腫瘤相關(guān)抗原識別，來調(diào)整抗腫瘤的響應(yīng)，但NK細(xì)胞同樣存在免疫檢查點(diǎn)的激活或抑制機(jī)制。雖然目前在細(xì)胞因子治療方法，以及NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移等方面有所進(jìn)步，但是，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的針對NK細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的配體，仍然能夠抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解。于是NK細(xì)胞功能缺失，腫瘤逃逸，病情加劇。因此目前有一些新的藥物被研發(fā)出來，針對腫瘤-NK細(xì)胞的抑制型免疫檢查點(diǎn)，以限制這種抑制作用。

        當(dāng)細(xì)胞在病毒感染向腫瘤轉(zhuǎn)化期間，產(chǎn)生了應(yīng)激壓力或DNA損傷，就會產(chǎn)生胚系編碼配體（germ-line ligand），這些配體可以被NK細(xì)胞表達(dá)的胚系編碼受體（germ-line receptor）識別。而當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)低表達(dá)MHC-I的情況時，就會觸發(fā)“丟失自我”殺傷機(jī)制。因此為了最大程度地減少對正常細(xì)胞或組織的殺傷，必須微妙的平衡這種激活或抑制的信號，以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。

        NK細(xì)胞表面激活型的受體包括：自然細(xì)胞毒性引發(fā)受體（NCRs）、SLAM家族受體、c型凝集素、CD16（FcγRIII）。例如CD16并不識別細(xì)胞表達(dá)的配體，而是識別細(xì)胞結(jié)合的IgG抗體的Fc部分，而且單獨(dú)通過CD16就足夠引發(fā)強(qiáng)大的激活信號且克服大部分抑制信號，引發(fā)NK細(xì)胞-抗體介導(dǎo)的ADCC。另外，C型凝集素的同二聚體NKG2D，識別細(xì)胞表面因DNA損傷或應(yīng)激壓力而上調(diào)的分子。這些激活型受體結(jié)合配體后，還能引發(fā)細(xì)胞因子比如IFN-γ、TNF-α的分泌，其中IFN-γ可誘導(dǎo)周圍細(xì)胞MHC-I的表達(dá)，增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞的識別能力（圖1）。

        NK細(xì)胞表面抑制型的受體包括：殺傷細(xì)胞免疫球蛋白類似受體（KIRs）、c型凝集素受體（NKG2A/CD94）、白細(xì)胞免疫球蛋白類似受體（LILRs）、常見的免疫檢查點(diǎn)受體（PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT）。它們當(dāng)中大部分的配體，是MHC-I，而廣泛表達(dá)的MHC-I配體介導(dǎo)的抑制信號，對于NK細(xì)胞響應(yīng)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。這些抑制型受體的表達(dá)，因NK細(xì)胞亞群不同而不同，比如CD56bright的NK細(xì)胞都表達(dá)NKG2A/CD94，而不表達(dá)KIRs，但是CD56dim的細(xì)胞只有約50~60%表達(dá)NKG2A/CD94，70~75%表達(dá)KIRs。

圖3 NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的激活或抑制型受體-配體相互作用

NK細(xì)胞的響應(yīng)被這些激活或抑制型的相互作用的平衡微妙地調(diào)節(jié)，而這些NK細(xì)胞受體的表達(dá)取決于NK細(xì)胞的亞群，以及腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子或可溶性配體。同時，腫瘤細(xì)胞表達(dá)對應(yīng)的配體，也依賴于腫瘤類型和微環(huán)境。

        腫瘤細(xì)胞分裂期間，一定程度地引起DNA損傷，這會誘導(dǎo)NKG2D和DNAM-1的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過上調(diào)非經(jīng)典的MHC-I，即HLA-G的表達(dá)，結(jié)合NK細(xì)胞的抑制型受體LIR-1，規(guī)避NK細(xì)胞的識別和殺傷。同時，腫瘤細(xì)胞也可以通過可溶性的NKG2D的配體，規(guī)避殺傷。這些配體通過可變剪切的方式，從腫瘤細(xì)胞表面脫落。于是NK細(xì)胞難以通過激活型受體NKG2D與其配體結(jié)合，也就難以激活對腫瘤細(xì)胞的殺傷。同時，這些可溶性的NKG2D配體，可以結(jié)合遠(yuǎn)處近處的NK細(xì)胞的NKG2D激活型受體，使其處于持續(xù)激活狀態(tài)，而降低了NK細(xì)胞識別的敏感性。

        一些位于腫瘤微環(huán)境中的抑制型免疫細(xì)胞，比如骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞（Treg）可以抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。MDSCs通過分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，其中TGF-β可以下調(diào)NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，或者通過細(xì)胞接觸的方式，抑制NK細(xì)胞的活性。同樣的，Treg也可以通過膜表面的TGF-β抑制NK細(xì)胞的活性，且Treg也通過競爭性消耗IL-2以減少IL-2對NK細(xì)胞的激活。

        關(guān)于NK細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)，同樣存在著可能的負(fù)調(diào)控機(jī)制（圖3展示了一部分）：

        PD-1，在B細(xì)胞和T細(xì)胞表面存在誘導(dǎo)性表達(dá)，同樣的，在NK細(xì)胞表面也有表達(dá)，盡管表達(dá)特性并不清楚，但PD-1減弱免疫功能的機(jī)制是明確的。不過，當(dāng)NK細(xì)胞提升對腫瘤細(xì)胞的響應(yīng)時，特別是IFN-γ分泌時，可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞PD-1配體的上調(diào)表達(dá)，從而反饋抑制NK細(xì)胞的響應(yīng)。

        CTLA-4，在激活的鼠源NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)。但目前幾乎沒有線索能直接說明，人源NK細(xì)胞表達(dá)CTLA-4的相關(guān)活性。

        TIGIT，帶有Ig和ITIM（細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的抑制模體）結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體，通常在NK細(xì)胞上有所表達(dá)，屬于抑制型受體，與DNAM-1共享PVR和Nectin-2受體。許多腫瘤過表達(dá)TIGIT的配體，CD155，這與腫瘤的增殖和遷移有關(guān)。在腫瘤環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞和Treg都會上調(diào)表達(dá)TIGIT，而阻斷TIGIT能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的功能。類似的，阻斷TIGIT能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性的能力。有數(shù)據(jù)表明，MDSC通過TIGIT信號通路，抑制NK細(xì)胞的活性。

        KIR，殺手細(xì)胞免疫球類似受體，有抑制型和激活型兩種，針對抑制型的KIR的阻斷，是免疫治療的主攻方向。抑制型KIR有兩類，表達(dá)2個胞外免疫球類似結(jié)構(gòu)域（KIR2DL），或者表達(dá)3個免疫球類似結(jié)構(gòu)域（KIR3DL）。兩類KIR的信號通路都通過ITIM（細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的抑制模體）實現(xiàn)。KIR能夠識別并結(jié)合MHC-I，以抑制NK細(xì)胞的活性。在NK細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)階段，KIR與自身的MHC-I的相互作用，對于NK細(xì)胞“教育”的動態(tài)過程非常關(guān)鍵。盡管在腫瘤環(huán)境中，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)激活型受體，但許多腫瘤能夠保留它們的MHC-I，從而能夠限制KIR表達(dá)NK細(xì)胞的響應(yīng)和殺傷能力。而KIR信號通路的阻斷型抗體，能夠起到一定的腫瘤治療的效果（圖4）。

        KIR抗體，IPH2101，在針對那些完全緩解狀態(tài)的急性髓細(xì)胞樣白血病患者的I期臨床研究中，顯示KIR結(jié)合發(fā)生在90%以上的NK細(xì)胞中（2周，最小劑量1mg/kg體重）。KIR抗體的治療也升高了TNF-α和MIP-1β的血清濃度，以及NK細(xì)胞早期的激活標(biāo)簽CD69。在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，KIR抗體也產(chǎn)生了類似的效果。然而，在關(guān)于郁積性多發(fā)性骨髓瘤（MM）的II期臨床中，并沒有顯著療效。這可能與IPH2101介導(dǎo)的KIR2D受體的胞啃作用有關(guān)，即通過KIR抗體的ADCC作用，KIR2D受體被“啃掉”并轉(zhuǎn)移到其他免疫細(xì)胞。盡管KIR抗體有效地阻斷了KIR2D的信號通路，但是也阻斷了這些表達(dá)KIR2D的NK細(xì)胞被“教育”（結(jié)合MHC-I）的能力，最終可能導(dǎo)致NK細(xì)胞對MM細(xì)胞的響應(yīng)清零。這個難題也揭示了，在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，靶向檢查點(diǎn)抑制研發(fā)所存在的一些挑戰(zhàn)。

圖4 NK細(xì)胞相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的抗體，以及它們的臨床研究進(jìn)展（截至2017年）

        C型凝集素異二聚體NKG2A/CD94，在NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上都有表達(dá)。它屬于抑制型受體，對應(yīng)的配體是HLA-E，可強(qiáng)烈抑制血液循環(huán)中的NK細(xì)胞。在很多腫瘤類型比如實體瘤或血癌中，上調(diào)編導(dǎo)HLA-E，從而減弱表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞的響應(yīng)。在異源和自體造血干細(xì)胞移植中，NKG2A廣泛表達(dá)于新生的NK細(xì)胞上，它與HLA-E的相互作用成為移植性治療后NK細(xì)胞活性的主要抑制因素。在這個條件下，NK細(xì)胞通過減少NKG2A的表達(dá)，恢復(fù)NK細(xì)胞功能，并最終成熟。但在NK細(xì)胞完全成熟之前，阻斷NKG2A也可以恢復(fù)功能，因此NKG2A的功能抑制型抗體也有希望用于治療腫瘤。

        Tim-3，T細(xì)胞免疫球和黏液素結(jié)構(gòu)域包含分子，是T細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。小鼠中抗Tim-3的作用，導(dǎo)致自發(fā)性的自身免疫作用。在晚期胃癌和肺腺癌患者的外周NK細(xì)胞中，Tim-3上調(diào)表達(dá)。同時，在75%的胃腸道間質(zhì)瘤患者中，腫瘤濾過性的NK細(xì)胞上有表達(dá)Tim-3。NK細(xì)胞表達(dá)的Tim-3的具體功能并不明確。源自晚期黑色素瘤的患者的功能受限的NK細(xì)胞，通過Tim-3拮抗劑的治療，功能可獲得恢復(fù)。然而，阻斷Tim-3和它的配體galectin-9的相互作用，減少了健康NK細(xì)胞對急性髓性白血?。ˋML）的IFN-γ的產(chǎn)生。在對PD-1的阻斷有抗性的患者中，Tim-3發(fā)生了阻斷，同時Tim-3表達(dá)被上調(diào)，因此Tim-3被認(rèn)為存在抑制免疫活性的作用。

        Lag-3，淋巴細(xì)胞激活基因3，表達(dá)在CD4+和CD8+T細(xì)胞上。因只有小部分NK細(xì)胞表達(dá)Lag-3，并且NK細(xì)胞與MHC-II并不相互作用，因此Lag-3的功能還不是很清楚。

圖5 IL-2/IL-2Rα和IL-15/IL-15Rα的結(jié)構(gòu)示意圖

IL-2和IL-15共享受體的兩個亞基，即IL-2Rβγ和IL-15Rβγ完全相同，雙亞基復(fù)合體以中親和力受體存在，而結(jié)合了IL-2Rα或IL-15Rα的三亞基復(fù)合體，則以高親和力受體存在。NK細(xì)胞表達(dá)中等親和力的IL-2和IL-15受體。通常情況下，IL-2通過順式作用，即先于同一細(xì)胞的IL-2Rα結(jié)合，然后與βγ結(jié)合，但NK細(xì)胞沒有表達(dá)IL-2Rα，需要較高濃度的IL-2才能激活。而IL-15通過反式作用，即先于另一細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞）的IL-15Rα結(jié)合，然后與βγ結(jié)合。

        NK細(xì)胞可以通過兩種方式克服抑制，一是激活型細(xì)胞因子，比如IL-2、IL-15，二是CD16（FcγRIII）介導(dǎo)的NK細(xì)胞激活。IL-2和IL-15共享相同的βγ-受體亞基，而各自的α受體亞基可以提高它們在受體上的親和力，它們結(jié)合對應(yīng)的高親和或中親和受體，激活JAK-STAT信號通路，最終誘導(dǎo)更多的細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞毒性的效應(yīng)功能，以及增殖和存活。

        IL-2治療已經(jīng)被大量研究，但是單獨(dú)使用IL-2所產(chǎn)生的療效并不顯著。IL-2的一項缺點(diǎn)是，盡管它能夠激活NK細(xì)胞，但同時，它也可以增強(qiáng)Treg的活性，限制NK細(xì)胞的響應(yīng)。高劑量IL-2治療腎癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，只能讓小部分患者的病情緩和，并且殘留有大量細(xì)胞毒性。因為低劑量的IL-2更利于激活Treg的功能，所以IL-2治療受限，而IL-15對于NK細(xì)胞依然有較好的刺激效果，且不會激活Treg的功能。

        IL-15被用于實體瘤的治療，以及在白血病患者中，維持NK細(xì)胞數(shù)量和活性。臨床前、非人類哺乳動物以及早期臨床的數(shù)據(jù)都表明，IL-15可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞數(shù)量上升。其中IL-15與IL-15Rα的反式呈遞，對最大化IL-15功效是必要的。ALT-803（IL-15N72D/IL-15Rα-Fc超級激動劑），在最近針對卵巢癌的鼠模型研究中，使NK細(xì)胞非常顯著地去顆?；?，并導(dǎo)致細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生。如ALT803能夠使卵巢癌患者腹水中的NK細(xì)胞恢復(fù)活性。同時，在抗CD20抗體的聯(lián)合作用下，ALT803增強(qiáng)了CD16引發(fā)NK細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞的清除。IL-15一方面能夠協(xié)助越過免疫檢查點(diǎn)的抑制機(jī)制，另一方面能夠完善NK細(xì)胞上CD16介導(dǎo)的功能，因此它成為了新的熱門免疫治療靶點(diǎn)。

        CD16a，即FcγRIIIa，NK細(xì)胞表達(dá)的Fc低親和受體，介導(dǎo)抗體的直接殺傷ADCC。CD16a表達(dá)在CD56dim的NK細(xì)胞上，這些NK細(xì)胞在健康個體內(nèi)，占有至少80%的所有外周的NK細(xì)胞。CD16a與Fc結(jié)合后，通過ITAM信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的去顆粒化。與NK細(xì)胞的其他激活型受體不同，CD16a與Fc的結(jié)合不需要協(xié)同激活，就可以產(chǎn)生強(qiáng)力的響應(yīng)，這也使得NK細(xì)胞能夠在病毒感染和腫瘤形成早期，通過抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而，NK細(xì)胞表達(dá)的CD16a對不同抗體的Fc親和力有所差異，介導(dǎo)的ADCC的效果參差不齊。因此，開發(fā)BiKE和TriKE之類的分子，能改進(jìn)親和力，并且可以針對不同的腫瘤相關(guān)抗原。

圖6 BiTE和BiKE

BiTE能夠同時結(jié)合T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，具有兩條scFv串聯(lián)結(jié)構(gòu)的抗體，分別結(jié)合T細(xì)胞的CD3ε（TCR亞基）和腫瘤細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原。而BiKE則能夠同時結(jié)合NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與BiTE相近，結(jié)合NK細(xì)胞的CD16a，強(qiáng)化ADCC作用，以及腫瘤相關(guān)抗原。新一代的BiTE甚至加入了抗PD-1/PD-L1的scFv，以減少免疫檢查點(diǎn)抑制。類似的原理（圖3），BiKE可以融合IL-15或拮抗前述受體信號通路的scFv（TriKE），移除免疫抑制或增強(qiáng)免疫響應(yīng)。

        激活NK細(xì)胞、解除NK細(xì)胞的免疫抑制、限制NK細(xì)胞毒性的時空。

        新的針對NK細(xì)胞的研究，比如仿照BiTE思路而來的BiKE（圖6），以及仿照CAR-T思路的CAR-NK（另文描述）。BiTE加上抗PD-1的部分成為了CiTE（檢查點(diǎn)抑制T細(xì)胞連接抗體），那么BiKE加上了IL-15的部分而成為了TriKE（三功能NK細(xì)胞連接抗體，圖7，8）：

圖7 CiTE和TriKE

圖8 TriKE的臨床研究正在招募中

        如果說，TriKE給我們提供了增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫響應(yīng)和特異性的參考，那么如何武裝NK細(xì)胞，是可以關(guān)注的點(diǎn)。一方面，抑制NK細(xì)胞的抑制性信號通路，比如抗體阻斷NK細(xì)胞表面的抑制型受體，或者激活NK細(xì)胞，通過結(jié)合激活型受體的配體，比如IL-2、IL-15、Fc等；另一方面，提高NK細(xì)胞，尤其是滲透到腫瘤組織的NK細(xì)胞的有效性，提高針對腫瘤細(xì)胞的特異性，比如利用抗腫瘤的單抗。那又如何將這幾方面的優(yōu)勢綜合起來“武裝”NK細(xì)胞？

        細(xì)胞因子對腫瘤的治療效果，因為受到藥物傳遞的限制，無法在腫瘤病灶部位產(chǎn)生足夠的活性，比如之前提到過IL-2的局限性。為了最大化細(xì)胞因子的治療效果，重組的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白被廣泛研究，以增強(qiáng)單抗靶向腫瘤的能力。如此，細(xì)胞因子通過單抗，被引導(dǎo)至特異性的腫瘤部位，能夠刺激引發(fā)更多有效的抗腫瘤響應(yīng)，并且避免單獨(dú)使用細(xì)胞因子時會造成的系統(tǒng)性的細(xì)胞毒性。

圖9 用于免疫治療的細(xì)胞因子，其中一些還處于臨床研究階段

        細(xì)胞因子是多肽或蛋白質(zhì)，在重組基因表達(dá)上，容易實現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，只需將INFs、ILs之類的融合在抗體的N端或C端。比如羅氏在研的RG7813（圖10），包含抗CEA單抗，且其中一條重鏈的C端融合改造后的IL-2。同樣的，前文提到的TriKE，基于scFv抗體，以拉近NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并通過融合細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞的活性。

圖10 RG7813示意圖

抗CEA單抗特異性結(jié)合CEA最靠近細(xì)胞膜表面的結(jié)構(gòu)域，而不結(jié)合因酶切作用而進(jìn)入血液的可溶性部分，sCEA屬于腫瘤細(xì)胞抑制體液免疫的作用。IL-2通過突變改造，偏向于結(jié)合IL-2中等親和力受體IL-2Rβγ，從而激活NK細(xì)胞或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因為IL-2存在，F(xiàn)c的ADCC/CDC的活性被取消，為了長效作用仍保持FcRn的結(jié)合，并且因為單側(cè)結(jié)合IL-2，引入KiH技術(shù)實現(xiàn)Fc的異二聚化。

        設(shè)計理想中的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白，包括以下步驟：

        選擇合適的靶向抗原：在正常組織中表達(dá)量極低的腫瘤相關(guān)抗原，以減少抗體“沉沒”在正常組織中而無法發(fā)揮藥效，同時也需要腫瘤組織中盡可能高表達(dá)，以便富集足夠多的細(xì)胞因子。細(xì)胞表面的抗原，結(jié)合后不會被細(xì)胞吸收，這樣可以延長融合細(xì)胞因子的半衰期。腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原也可以，比如與腫瘤遷移、浸潤相關(guān)的細(xì)胞因子。在血液循環(huán)中沒有顯著的數(shù)量，比如sCEA，能夠持續(xù)性消耗激活的免疫細(xì)胞，使這些免疫細(xì)胞無法造成有效殺傷。

        選擇合適的細(xì)胞因子：考慮細(xì)胞因子靶向到腫瘤細(xì)胞的目的，還沒有一種單一的細(xì)胞因子具有所有的抗腫瘤的特性。是為了激活和輔助增殖T細(xì)胞、NK細(xì)胞還是巨噬細(xì)胞？是否需要直接作用于腫瘤細(xì)胞，還是用于抑制腫瘤組織血管的形成？細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷機(jī)制，誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還是ADCC，還是直接作用？本文優(yōu)先考慮對NK細(xì)胞的激活作用。

        結(jié)構(gòu)的選擇：完整的抗體結(jié)構(gòu)，scFv，F(xiàn)ab等等。

        融合細(xì)胞因子的生物活性：通過定量比較，維持完全的親和力和生物活性，或者減弱活性以減少脫靶造成的系統(tǒng)性細(xì)胞毒性。正常組織中，過高的親和力可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性。而結(jié)合到靶細(xì)胞后，也要注意抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬，除非細(xì)胞因子靶向作用于巨噬細(xì)胞。這會使融合的細(xì)胞因子被巨噬細(xì)胞吞噬和消除。因此，如果用到了Fc融合，F(xiàn)c往往需要通過改造以減少細(xì)胞因子的非特異消耗。

        PK和PD：足夠長的半衰期，以便于在腫瘤部位富集。

        臨床前藥效估計：在腫瘤模型動物實驗中，檢測抗腫瘤藥效和免疫毒性。

        劑量和使用規(guī)劃：在腫瘤微環(huán)境以及宿主的免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下，基于耐受性和藥代的效果制定。

參考文獻(xiàn)

1. NLRC5/MHC class I transactivator is a target for immune evasion in cancer.(2016), PNAS, Sayuri Yoshihama, Jason Roszik, Isaac Downs, et al.

2. Trends in the global immuno-oncology landscape. (2018) Nature Reviews. Jun Tang, Laura Pearce, Jill O’Donnell-Tormey and Vanessa M.Hubbard-Lucey.

3. A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization. (2018) Cell. Miguel F. Sanmamed and Lieping Chen.

4. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. (2013) Cancer discovery. Michel Sadelain, Renier Brentjens, and Isabelle Riviere

5. Cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v), a CEA-targeted IL-2 variant-based immunocytokine for combination cancer immunotherapy: Overcoming limitations of aldesleukin and conventional IL-2-based immunocytokines. (2017) Oncoimmunology.Christian Klein, Inja Waldhauer, et al.

6. Targeted killing of colorectal cancer cell lines by a humanised IgG1 monoclonal antibody that binds to membrane-bound carcinoembryonic antigen.(2008) British Journal of Cancer.PJ Conaghan, SQ Ashraf.

7. Natural Killer Cells Unleashed: Checkpoint receptor blockade and BiKE/TriKE utilization in NK-mediated anti-tumor immunotherapy. (2017) SeminImmunology. Zachary B. Davis, Daniel A. Vallera, Jeffrey S. Miller, and Martin Felices.

8. Antibody-cytokine Fusion Proteins for Treatment of Cancer: Engineering Cytokines for Improved Efficacy and Safety. (2014) Semin Immunology. PatriciaA. Young, Sherie L. Morrison, and John M. Timmerman. 

9. ESMO HANDBOOK OF IMMUNO-ONCOLOGY. Edited by John B.A.G. (2018) Haanen,Raffaele Califano, Iwona Lugowska, Marina Chiara Garassino.